暗場(chǎng)顯微成像技術(shù)（DFM）和表面增強(qiáng)的拉曼光譜（SERS）等新興的分析技術(shù), 已廣泛應(yīng)用于化學(xué)檢測(cè)和生物傳感的快速診斷分析。近期，卓立漢光集團(tuán)拜訪合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院劉洪林教授課題組，課題組基于DFM和SERS這兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)，在開(kāi)發(fā)活細(xì)胞膜表面納米尺和獼猴桃軟腐病致病菌屬鑒定方面開(kāi)展了相關(guān)研究工作。

首先為大家?guī)?lái)劉教授團(tuán)隊(duì)有關(guān)細(xì)胞膜表面納米尺相關(guān)研究工作，該研究成果以“Plasmon Resonance Energy Transfer Nanoruler for Pinpointing Molecular Distance and Interaction on the Living Cell Membrane”為題發(fā)表在Nano letters 期刊中（doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c01629）。

近年來(lái)，光學(xué)納米尺的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，如Förster共振能轉(zhuǎn)移 (FRET) 和納米金屬表面能轉(zhuǎn)移(NSET) 等是常用的光學(xué)納米尺。其中FRET具有良好的準(zhǔn)確性，但其測(cè)量范圍往往被限制在10 nm以內(nèi)；NSET克服了10 nm的限制，具有較長(zhǎng)的檢測(cè)量程，但其在r0的確定和測(cè)量存在挑戰(zhàn)。此外，依賴于熒光檢測(cè)的傳統(tǒng)納米尺不可避免的存在自猝滅和光漂白等不穩(wěn)定性。因此，開(kāi)發(fā)可靠、有效的方法以提高納米尺的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，特別是在活細(xì)胞體系中，一直是令人著迷但富有挑戰(zhàn)性的課題。PRET是發(fā)生在供體納米金屬表面和受體分子間的非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，等離子體金屬表面與共振分子偶極間的相互作用導(dǎo)致能量傳遞，這一過(guò)程可以通過(guò)高信噪比、穩(wěn)定性和靈敏度的暗場(chǎng)顯微鏡觀察。

近日，課題組報(bào)道了單個(gè)納米金顆粒和單個(gè)分子偶極之間的PRET現(xiàn)象。研究團(tuán)隊(duì)使用兩種無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的配體，即適體XQ-2d-Cy3和抗體antiCD71，識(shí)別活細(xì)胞膜上同一受體蛋白CD71的不同位點(diǎn)；適體攜帶小分子熒光標(biāo)簽作為能量受體，抗體攜帶單粒徑的金顆粒作為供體，觀察到了能量供體與受體之間無(wú)任何“系繩”連接的PRET現(xiàn)象?；诖嗽恚瑯?gòu)筑了靈活的PRET光學(xué)納米尺，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞表面分子距離和蛋白互作的觀察與測(cè)量。有限元理論模擬和暗場(chǎng)成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，該PRET納米尺在活細(xì)胞膜表面測(cè)量位點(diǎn)分離距離和蛋白互作具有可行性和穩(wěn)定性，在分析科學(xué)納米尺度測(cè)量領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖 1. PRET納米尺的理論可行性和探針表征

理論上，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)有限元分子動(dòng)力學(xué)模擬了單個(gè)金顆粒和單分子偶極之間的PRET過(guò)程。金顆粒具有強(qiáng)烈且連續(xù)的電場(chǎng)強(qiáng)度分布，單分子偶極的引入顯著降低了電場(chǎng)強(qiáng)度，且表現(xiàn)出明顯的距離依賴性。特別是兩者分離距離r小于5 nm時(shí)，單個(gè)金顆粒和單分子偶極之間存在顯著的PRET能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)非輻射能量躍遷機(jī)制，PRET能量損失可歸因于共振受體和溶液介質(zhì)通過(guò)偶極-偶極相互作用的非輻射能量傳遞。理論結(jié)果支持了單個(gè)金顆粒和單分子偶極之間PRET效應(yīng)的可行性。

圖2. 活細(xì)胞膜上暗場(chǎng)顯微鏡原位觀察PRET過(guò)程

實(shí)驗(yàn)上， 研究團(tuán)隊(duì)利用暗場(chǎng)顯微鏡在活細(xì)胞膜表面原位觀察了PRET過(guò)程，該暗場(chǎng)散射光譜數(shù)據(jù)采用北京卓立漢光儀器有限公司的RTS系列暗場(chǎng)顯微光譜系統(tǒng)檢測(cè)。一方面，依據(jù)距離依賴的淬滅效率經(jīng)驗(yàn)公式，計(jì)算得到PRET能量轉(zhuǎn)移效率為30±7%，進(jìn)一步得到兩個(gè)配體識(shí)別位點(diǎn)（適體XQ-2d-Cy3和抗體antiCD71）之間的分離距離為16.3±1.5 nm；另一方面根據(jù)有限元模擬結(jié)果可以推導(dǎo)出兩識(shí)別位點(diǎn)間距離范圍為13.0-18.0 nm。證明了該PRET納米尺具有一定的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性。

圖3. 活細(xì)胞膜上流式細(xì)胞術(shù)原位觀察NSET過(guò)程

此外，研究團(tuán)隊(duì)還利用流式細(xì)胞術(shù)在活細(xì)胞膜表面觀察了同一系統(tǒng)中 與PRET相反的能量轉(zhuǎn)移過(guò)程——NSET現(xiàn)象。即單獨(dú)激發(fā)熒光標(biāo)簽（XQ-2d-Cy3）時(shí)，可以反向觀察到XQ-2d-Cy3到金顆粒表面的能量轉(zhuǎn)移過(guò)程。

圖4. PRET納米尺測(cè)量活細(xì)胞膜表面分子距離和相互作用

轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf與適體XQ-2d-Cy3之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制了適體的結(jié)合，使得活細(xì)胞膜表面降低的金顆粒散射信號(hào)有所恢復(fù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了PRET能量轉(zhuǎn)移過(guò)程的發(fā)生，展現(xiàn)了該PRET納米尺測(cè)量分子分離距離、蛋白質(zhì)互作、分子靶標(biāo)識(shí)別等方面的可行性。

合肥工業(yè)大學(xué)劉洪林課題組簡(jiǎn)介

劉洪林，博士，教授，博士生導(dǎo)師，黃山學(xué)者，國(guó)家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目首席科學(xué)家。入選合肥市高層次人才、安徽省級(jí)領(lǐng)軍人才。獲得中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)學(xué)士和工學(xué)博士學(xué)位。主要從事食品安全領(lǐng)域的化學(xué)與生物傳感分析、食品質(zhì)量安全評(píng)價(jià)與監(jiān)控技術(shù)研究。

已主持國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家優(yōu)秀青年科學(xué)基金、省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目10余項(xiàng)。已在Nature Commun.、J. Am. Chem. Soc.、Anal. Chem.、Food Chem.、LWT等雜志發(fā)表論文50余篇，入選全球Top 1%“ESI”高引論文，獲得安徽省自然科學(xué)論文一等獎(jiǎng)、安徽省自然科學(xué)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)等獎(jiǎng)勵(lì)。

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本研究暗場(chǎng)散射光譜數(shù)據(jù)采用的是我司RTS系列暗場(chǎng)顯微光譜系統(tǒng)檢測(cè)測(cè)，該系列已升級(jí)為RTS2-Omni-Imager 暗場(chǎng)散射顯微高光譜儀。如需了解產(chǎn)品，歡迎咨詢。

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